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病毒DNA提取試劑盒的應(yīng)用
背景[1-3]
病毒DNA提取試劑盒采用高效、專(zhuān)一結(jié)合核酸的離心吸附柱和緩沖系統(tǒng)，適合從血漿、血清和其它無(wú)細(xì)胞體液等樣品中分離純化病毒的DNA或者RNA，本試劑盒加入了Carrier RNA，可以從體系中輕松捕獲微量核酸,具有方便快捷、產(chǎn)量高、重復(fù)性好的特點(diǎn)。所得病毒基因組DNA或RNA無(wú)蛋白、核酸酶或其它雜質(zhì)的污染，可直接用于PCR、酶切、雜交、反轉(zhuǎn)錄等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

病毒DNA提取試劑盒
產(chǎn)品特點(diǎn)：
快速純化得到高質(zhì)量病毒DNA和RNA。
無(wú)有機(jī)抽提或乙醇沉淀。
重復(fù)性強(qiáng)，產(chǎn)量高。
完全去除污染物和抑制劑，方便下游應(yīng)用。

病毒是一類(lèi)個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，只含單一核酸，必須在活細(xì)胞內(nèi)寄生并以復(fù)制方式增殖的非細(xì)胞型微生物。病毒在自然界分布廣泛，可感染人體細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)解體釋放出核酸分子，借細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的條件以獨(dú)特的生命活動(dòng)體系進(jìn)行復(fù)制，常引起人體發(fā)病。目前知道的DNA病毒有乙肝病毒，T2噬菌體，天花病毒，花椰菜花葉病毒等，病毒DNA提取試劑盒適用于所有的感染人類(lèi)的血液中的病毒基因組DNA的提取，在已知的DNA病毒中，因?yàn)橐腋尾《緦?duì)人類(lèi)的影響和危害*大，傳染性*強(qiáng)，因此病毒DNA提取試劑盒尤其適用于乙肝病毒基因組DNA的提取。

實(shí)驗(yàn)步驟：
樣品首先被蛋白酶K消化，隨后加入適合DNA結(jié)合到純化柱上的緩沖液，然后加入到純化柱內(nèi)。通過(guò)高速離心，使DNA在穿過(guò)純化柱的瞬間，結(jié)合到純化柱上，隨后通過(guò)兩次洗滌去除各種雜質(zhì)，*后通過(guò)洗脫液把DNA洗脫下來(lái)。整個(gè)過(guò)程無(wú)需酚氯仿抽提，無(wú)需酒精沉淀，樣品裂解后僅需約15分鐘即可完成。

病毒DNA提取試劑盒的應(yīng)用
用于核盤(pán)菌DNA病毒SsHADV-1的基因功能和入侵機(jī)制研究
探討了病毒SsHADV-1的衣殼蛋白Cp和復(fù)制相關(guān)蛋白R(shí)ep在核盤(pán)菌中的生物學(xué)功能。利用**啟動(dòng)子PtrpC或EF-1α,獲得了在核盤(pán)菌菌株Ep-1PNA367中超量表達(dá)Cp和Rep基因的轉(zhuǎn)化子。兩種類(lèi)型的轉(zhuǎn)化子中病毒的Cp和Rep基因可以單獨(dú)或共同轉(zhuǎn)錄,但是均檢測(cè)不到病毒蛋白翻譯。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在菌絲**形態(tài)、菌落形態(tài)、及產(chǎn)酸能力和致病力上均與菌株Ep-1PNA367不存在顯著性差異。

此外,SsHADV-1病毒能通過(guò)菌絲融合自攜帶病毒的核盤(pán)菌水平傳播至表達(dá)Cp和Rep轉(zhuǎn)化子中,據(jù)此推測(cè)病毒Cp或Rep在核盤(pán)菌中超表達(dá)均不能抗病毒。利用SsHADV-1外殼蛋白Cp單克隆抗體對(duì)攜帶病毒菌株的總蛋白進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng),獲得核盤(pán)菌中61個(gè)與病毒Cp互作的候選蛋白。

分析了SsHADV-1病毒粒子直接進(jìn)入核盤(pán)菌菌絲的分子機(jī)制。通過(guò)高通量測(cè)序在轉(zhuǎn)錄水平上分析了病毒粒子侵染菌絲早期（1 h-3 h）的核盤(pán)菌差異表達(dá)基因,發(fā)現(xiàn)在核盤(pán)菌菌絲受SsHADV-1病毒粒子侵染后,共有187個(gè)基因顯著差異表達(dá),其中114個(gè)上調(diào)表達(dá),73個(gè)下調(diào)表達(dá)。受病毒粒子侵染的差異表達(dá)基因主要參與到生物代謝、***和次級(jí)代謝產(chǎn)物合成途徑。

細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析表明有26%的差異基因與膜結(jié)構(gòu)相關(guān),且10個(gè)基因被預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞膜上。30%有功能注釋的基因預(yù)測(cè)參與Ras-small G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。因此,推測(cè)SsHADV-1病毒粒子在侵染初期可能結(jié)合宿主膜蛋白,并在感染過(guò)程中通過(guò)Ras-small G蛋白偶聯(lián)受體進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。明確了受病毒SsHADV-1侵染影響的核盤(pán)菌基因SS1G06180生物學(xué)功能。

利用SsHADV-1病毒粒子直接侵染核盤(pán)菌Ep-1PNA367的菌絲,處理3 h時(shí)基因SS1G06180顯著下調(diào)表達(dá)。SS1G06180全長(zhǎng)1498 bp,在核盤(pán)菌中-功能未知,預(yù)測(cè)編碼一種蛋白激酶,且含有多個(gè)phos-PKC類(lèi)型磷酸化位點(diǎn)。該假定蛋白在5’端編碼含有Macoilin家族蛋白的跨膜結(jié)構(gòu),此外含有編碼Pal1的保守結(jié)構(gòu)域,預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞核內(nèi)。

通過(guò)病毒水平傳播,證明沉默基因SS1G06180的轉(zhuǎn)化子具有抗DNA,+ssRNA和dsRNA**病毒的特性,與典型的RNAi和甲基化抗病毒機(jī)制不相同。分析沉默基因SS1G06180的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果,發(fā)現(xiàn)沉默轉(zhuǎn)化子中酪氨酸和苯丙氨酸代謝、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成和甘油酯代謝等通路受到影響。野生型核盤(pán)菌在PDA上生長(zhǎng)第5 d（菌核原基形成）和第9 d（菌核成熟）時(shí),SS1G06180表達(dá)量較高。

獲得了敲除SS1G06180的轉(zhuǎn)化子,其表型為菌落較白,菌核數(shù)量減少,單個(gè)菌核增大,致病力下降。黑色素與菌核形成相關(guān),在敲除轉(zhuǎn)化子中黑色素合成信號(hào)通路的聚酮合酶基因PKS13明顯下調(diào)表達(dá),小柱孢酮脫水酶基因SCD1和還原酶基因T4HN顯著上調(diào)表達(dá),推測(cè)SS1G06180在核盤(pán)菌中參與黑色素合成從而影響菌核發(fā)育。前期的研究發(fā)現(xiàn)SsHADV-1不能感染灰葡萄孢,但是本研究表明SsHADV-1病毒粒子雖然不能直接侵染灰葡萄孢健康菌絲,但是病毒粒子可以通過(guò)PEG介導(dǎo)感染3個(gè)不同的灰葡萄孢菌株,且病毒可以在灰葡萄孢菌絲中復(fù)制和增殖。

獲得病毒SsHADV-1后的灰葡萄孢菌株B05.10-HADV平均生長(zhǎng)速度為11 mm/d,顯著低于不含病毒的灰葡萄孢B05.10（平均生長(zhǎng)速度為14 mm/d）。菌株B05.10-HADV菌落異常,其分生孢子攜帶病毒SsHADV-1的概率為1/20。從菌株B05.10-HADV中提取的DNA病毒粒子裂解獲得的病毒核酸與SsHADV-1有一個(gè)堿基的差別,在編碼病毒Rep的2086位堿基由C（胞嘧啶）堿基突變?yōu)門(mén)（胸腺嘧啶）堿基,對(duì)應(yīng)的氨基酸則由蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸。推測(cè)SsHADV-1的Rep區(qū)域單堿基突變可能造成了寄主范圍的改變。