文章詳情
酶法ELISA試劑盒操作步驟
日期：2024-12-22 17:11
瀏覽次數(shù)：271
摘要：
一、試驗(yàn)原理
酶法試劑盒（ELISA）試驗(yàn)原理是使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體外表，并保持其免疫活性；使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保存其免疫活性，又保存酶的活性。
在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的過程與固相載體外表的抗原或抗體起反響。用洗刷的辦法使固相載體上構(gòu)成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，終究結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的份額。參加酶反響的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)品，產(chǎn)品的量與標(biāo)...
一、試驗(yàn)原理
酶法ELISA試劑盒試驗(yàn)原理是使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體外表，并保持其免疫活性；使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保存其免疫活性，又保存酶的活性。
在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的過程與固相載體外表的抗原或抗體起反響。用洗刷的辦法使固相載體上構(gòu)成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，終究結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的份額。參加酶反響的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)品，產(chǎn)品的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)色彩反響的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可ji大地地放大反響作用，從而使測(cè)定辦法到達(dá)很高的敏感度。
二、酶法ELISA試劑盒操作過程
1.ELISA在操作前試劑和組分都先康復(fù)到室溫，規(guī)范品、質(zhì)控品和樣品，主張做復(fù)孔。按前面試劑預(yù)備中描述的辦法，配制好試劑盒各種組分的工作液。從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。
2.設(shè)置規(guī)范品孔、樣本孔和空白孔，規(guī)范品孔各加不同濃度的規(guī)范品50μL，樣本孔加待測(cè)樣本50μL，空白孔不加。除空白孔外，規(guī)范品孔和樣本孔，參加辣根過氧化物酶符號(hào)的檢測(cè)抗體100μL。用封板膜蓋住反響板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
3.溫育好后揭開封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗刷液，靜置20s，甩去洗刷液，吸水紙上拍干。如此重復(fù)4次（共洗板5次）。若使用主動(dòng)洗板機(jī)，請(qǐng)按洗板機(jī)操作程序進(jìn)行洗板，增加浸泡20s的程序，可以進(jìn)步檢測(cè)的精度。洗板結(jié)束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充沛拍干反響板。洗刷在ELISA過程中雖不是一個(gè)反響過程，但卻決議著試驗(yàn)的勝敗。ELSIA就是靠洗刷來到達(dá)別離游離的和結(jié)合的酶符號(hào)物的意圖。經(jīng)過洗刷以鏟除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反響過程中非特異性地吸附于固相載體的攪擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗刷時(shí)應(yīng)把這種非特異性吸附的攪擾物質(zhì)洗刷下來?？梢哉f在ELISA 操作中，洗刷是主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗刷，不得馬虎。
4.洗板好后將底物A和B按1:1體積充沛混合，所有孔中參加底物混合液100μL。用封板膜蓋住反響板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。所有孔參加停止液50μL，在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度（OD值）。
5.檢測(cè)完成后，以規(guī)范品濃度做為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度（OD值）作為橫坐標(biāo)，利用核算機(jī)軟件，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl），創(chuàng)立規(guī)范曲線方程，經(jīng)過樣本的吸光度（OD值），利用方程核算樣品的濃度值。如果樣品被稀釋，經(jīng)過上述辦法測(cè)的的濃度值，要乘以稀釋倍數(shù)，才是樣品的終究濃度。